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    I C S6 5 .0 2 0 .3 0 B4 4 囝亘 中华人民共和国国家标准 G B /T 14 9 2 6 .5 6 2 0 0 8 代替G B /T1 4 9 2 6 .5 6 2 0 0 1 实验动物狂犬病病毒检测方法 L a b o r a t o r ya n i m a l - - M e t h o df o re x a m i n a t i o no fR a b i e sv i r u s 2 0 0 8 - 1 2 - 1 0 发布 2 0 0 9 - 0 3 - 01 实施 丰瞀粥鬻瓣警糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪1 ” 刖置 G B /T1 4 9 2 6 .5 6 2 0 0 8 G B /T1 4 9 2 6 实验动物共5 4 个部分,为不同微生物和病毒检测技术方法。 本部分自实施之日起代替G B /T1 4 9 2 6 .5 6 2 0 0 1 实验动物狂犬病病毒检测方法。 本部分与G B /T1 4 9 2 6 .5 6 2 0 0 1 相比主要技术差异如下 a 删除原标准中“2 引用标准”内容; b 对原标准中“3 原理”中所有内容改为“在微孔板上预包被纯化狂犬病毒抗原,使免疫反应在 固相载体上进行。当被检血清中有狂犬病病毒抗体存在时,则与孔壁上的抗原形成抗原一抗体 复合物,再与抗犬I g G 酶标记物反应,最后通过测定酶作用底物催化后的产物,进行定性 检测”; c 删除原标准中所有关于血凝抑制试验的试剂、方法及结果判定; d 对原标准中所有关于酶联免疫吸附试验的内容进行修改,包括试剂、方法及结果判定等; e 对原标准中“6 结果判定”中增加了“6 .3 基础级犬群体免疫抗体合格率免疫抗体合格率一 被检动物抗体阳性数/被检动物总数 1 0 0 %?;〖度禾迕庖呖固搴细衤蚀锏? 0 %以 上可判为该犬群免疫合格”内容。 本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归口。 本部分由全国实验动物标准化技术委员会负责起草。 本部分主要起草人田克恭、陈西钊、曹振、王传彬、何秀敏、汤汉文。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为 G B /T1 4 9 2 6 .5 62 0 0 1 。 实验动物狂犬病病毒检测方法 G B /T1 4 9 2 6 .5 6 2 0 0 8 1 范围 G B /T1 4 9 2 6 的本部分规定了狂犬病病毒 R V 的检测方法、试剂等。 本部分适用于犬R V 的检测。 2 原理 在微孔板上预包被纯化狂犬病毒抗原,使免疫反应在固相载体上进行。当被检血清中有狂犬病病 毒抗体存在时,则与孔壁上的抗原形成抗原一抗体复合物,再与抗犬I g G 酶标记物反应,最后通过测定酶 作用底物催化后的产物,进行定性检测。 3 主要试剂和器材 3 .1 试剂 犬狂犬病毒I g G 抗体检测试剂盒 定性 ,包括 a 预包被狂犬病毒抗原的微孔板; b 狂犬病毒I g G 酶标记物; c 狂犬病毒I g G 阳性对照; d 狂犬病毒I g G 临界对照; e 狂犬病毒I g G 阴性对照; f 显色液A 磷酸氢一钠一柠檬酸缓冲液 o .0 5m o l /L ,p H 5 .o 10 0 0m L ,3 0 %过氧化氢H z O z M W 3 4 .0 3 .5m L ; g h i j 显色液B 柠檬酸1 .0 5 2g ,乙二胺四乙酸二钠 E D T A N a 0 .1 8 6g ,四甲基联苯胺 T M B 0 .2 5g ,二甲基亚砜 D M s O 8 .0m L ,纯化水9 9 2m L ; 终止液9 8 %硫酸2 7 .8m L ,纯化水9 7 2 .2m L ; 1 0 倍浓缩洗涤液P B S 0 .1m o l /Lp H 7 .2 ~7 .4 9 9 5m L ,吐温一2 0 ,5m L ; 样品稀释液硼酸盐缓冲液 0 .0 1m o l /Lp H 8 .O 9 5 6 .0m L ,甘油 M W 9 2 .0 9 4 0 .0m L ,酪蛋白 c a s e i n 1 0 %硫柳汞钠溶液2 .0m L ,吐温一2 0 ,1 .0m L1 %酚红溶液,1 .0 m L 。 试剂在使用前应恢复至室温 1 8 ℃~2 5 ℃ 。 3 .2 器材 器材包括 a 精密移液器1 0p L ~1 0 0t L L ; b 一次性移液器吸头; c 振荡器; d 酶标仪 含4 5 0n m 波长滤光片 ; e 3 7 ℃恒温培养箱; f 蒸馏水或去离子水; g 1 0 0 m L 量筒; h 离心机; i 吸水纸。 G B /T1 4 9 2 6 .5 6 2 0 0 8 4 检测方法 4 .1 样品的准备 将采集到的待检犬血液样品离心,分离出待检犬血清或血浆。应避免使用染菌、溶血和高血脂的样 品;室温保存样品不应超过8h ,若试验在8h 以后进行,需将样品保存在2 ℃~1 0 ℃,如保存超过i 周, 则应保存在一2 0 ℃并避免反复冻融。 4 .2 试剂配置 将1 0 倍浓缩洗涤液恢复至室温,并振摇,然后用去离子水或蒸馏水作1 0 倍稀释。 4 .3 稀释样品 将已分离好的犬血清或血浆用样品稀释液做1 1 0 稀释,即取5 0 止血清或血浆加入到5 0 0p L 样 品稀释液中,并充分混匀。 4 .4 加样 取所需量的预包被微孔板条固定于板架上,依次加入稀释好的样品,l O Op L /孔,然后将阳性、阴性 对照各加1 孔,临界对照加3 孔,1 0 0p L /孔,另留一孔不加样品作为空白对照,在记录纸上记录各样品 和对照的次序或位置,剩余的板条放人密封袋中保存。 4 .5 孵育 加样完成后,用封板膜覆盖板条,置3 7 ℃恒温培养箱中孵育3 0m i n 。 4 .6 洗板 甩净孔中液体,拍干,用稀释好的洗涤液加满每孔,停留lm i n 后甩净、拍干,如此重复洗涤3 次。 4 .7 加酶 除空白对照外,其余各孔垂直滴加酶标记物1 滴 5 0p L ,置3 7 ℃恒温培养箱孵育3 0m i n 。 4 .8 显色 重复步骤4 .6 洗板3 次,拍于后每孔 含空白对照孔 垂直滴加显色液A 、B 液各I 滴,置3 7 ℃恒温 培养箱避光显色1 0m i n 。 4 .9 终止 每孔 含空白对照孔 立即加入终止液1 滴,混匀后以空白孔调零,用酶标仪4 5 0n m 波长测定 A 值。 5 结果判定 5 .1 试验结果符合下列条件,方为有效以空白孔调零,阴性对照值小于等于0 .1 0 ,临界对照A 值应在 0 .1 5 ~o .4 0 之间,证明试验成立。 5 .2 结果判定 5 .2 .1 待检样品A 值大于等于临界对照A 值的平均值,判为阳性; 5 .2 .2 待检样品A 值小于临界对照A 值的平均值,判为阴性。 6 结果解释 6 .1 基础级犬接种疫苗后,经E L I S A 检测抗体效价达到阳性值判为合格。 6 .2 S P F 级犬,不应进行疫苗接种,对阳性检测结果,选用同一种方法或另一种方法重试。如为阳性 则判为阳性。 6 .3 基础级犬群体免疫抗体合格率 免疫抗体合格率一 被检动物抗体阳性数/被检动物总数 1 0 0 % 基础级犬群体免疫抗体合格率达到7 0 %以上可判为该犬群免疫合格。 2 7 结果报告 根据判定结果,作出报告。 G B /T1 4 9 2 6 .5 6 2 0 0 8
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