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    I C S6 5 .0 2 0 .3 0 B4 4 固亘 中华人民共和国国家标准 G B /T14 9 2 6 .10 2 0 0 8 代替G B /T1 4 9 2 6 .1 0 2 0 0 1 实验动物泰泽病原体检测方法 L a b o r a t o r ya n i m a l - - M e t h o df o re x a m i n a t i o no fT y z z e r ’So r g a n i s m 2 0 0 8 - 1 2 - 0 3 发布2 0 0 9 0 3 01 实施 中华人民共和国国家质里“- - - 皿I 督检验检疫总局岩者 中国国家标准化管理委员会及1 1 1 刖吕 G B /T1 4 9 2 6 .1 0 2 0 0 8 G B /T1 4 9 2 6 实验动物共5 4 个部分,为不同微生物和病毒检测技术方法。 本部分自实施之日起代替G B /T1 4 9 2 6 .1 0 一2 0 0 1 实验动物泰泽病原体检测方法。 本部分与G B /T1 4 9 2 6 .1 0 2 0 0 1 相比主要技术差异如下 a 删除了可的松激发试验; b 修改了两种血清学方法。 本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归口。 本部分起草单位全国实验动物标准化技术委员会。 本部分主要起草人李红。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为 G B /T1 4 9 2 6 .1 0 一1 9 9 4 ,G B /T1 4 9 2 6 .1 0 2 0 0 1 。 1 范围 实验动物泰泽病原体检测方法 G B /T1 4 9 2 6 的本部分规定了实验动物泰泽病原体的检测方法。 本部分适用于小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠和兔泰泽病原体的检测。 2 规范性引用文件 G B /T1 4 9 2 6 .1 0 2 0 0 8 下列文件中的条款通过G B /T1 4 9 2 6 的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文 件,其随后所有的修改单 不包括勘误的内容 或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本 部分。 G B /T1 4 9 2 6 .5 0 实验动物酶联免疫吸附试验 G B /T1 4 9 2 6 .5 2 实验动物免疫荧光试验 3 原理 动物感染泰泽病原体后血清中可产生相应的抗体。依据免疫学原理,采用泰泽病原体抗原检测小 鼠、大鼠、豚鼠、地鼠和兔血清中相应的抗体。 4 主要设备和材料 4 .1 普通恒温培养箱。 4 .2 荧光显微镜。 4 .3 生物显微镜。 4 .4 酶标仪。 4 .5 组织研磨器。 4 .6 聚苯乙烯板,4 0 孔、5 5 孔或9 6 孔 可拆或不可拆 ,用前洗净晾干,紫外光照射1h 。 4 .7 微量加样器,容量5p L ~5 0p L 、5 0p L ~2 0 0p L 。 4 .8 印有1 0 个~4 0 个小孔的载玻片。 4 .9 盖玻片。 4 .1 0 超低温冰箱或液氮罐。 5 培养基和试剂 5 .1E L I S A 抗原 5 .1 .1 泰泽病原体抗原 受泰泽病原体感染的、带有严重坏死灶的动物肝脏按1 1 0 加入P B S 后在冰浴中用组织研磨器制 成匀浆,36 0 0r /m i n 离心,取上清液作抗原。 5 .1 .2 阴性对照抗原 未受泰泽病原体感染的动物肝脏,按5 .1 .1 的方法制成。 5 .2 抗原片 5 .2 .1 抗原 受泰泽病原体感染的、带有严重坏死灶的动物肝组织用P B S 按1 1 0 在冰浴中制成匀浆,调整浓 1 G B /T1 4 9 2 6 .1 0 2 0 0 8 度至每个显微镜油镜视野有适当的菌量,即细菌、肝细胞、细胞碎片完全铺开,不重叠。泰泽病原体自溶 现象严重,应尽快完成该过程。 5 .2 .2 抗原片制备 将上述抗原液适量滴于玻片孔中,室温干燥后,冷丙酮 4 ℃ 固定1 0m i n 。P B S 漂洗后充分干燥, 置于一2 0 ℃备用。 5 .3 酶结合物 辣根过氧化物酶标记的羊或兔抗小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠I g G 抗体,用于检测相应动物的抗体;辣根 过氧化物酶标记的羊抗兔I g G 抗体,用于检测兔血清抗体;辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌蛋白A S P A ,用于检测大鼠血清以外的动物血清抗体。 5 .4 荧光结合物 荧光标记的羊或兔抗小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠I g G 抗体用于检测相应动物的血清抗体;荧光标记的 羊抗兔I g G 抗体,用于检测兔血清抗体。 5 .5 阳性血清 上述抗原免疫清洁级或S P F 级小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠或无泰泽病原体感染的兔获得的抗血清。 5 .6 阴性血清 清洁级或S P F 级小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠血清;或无泰泽病原体感染的兔血清。 5 .7 5 0 %甘油P B S 。 5 .8 其他试剂溶液的配制见G B /T1 4 9 2 6 .5 0 和G B /T1 4 9 2 6 .5 2 。 6 检测方法 6 .1酶联免疫吸附试验 E L I S A 6 .1 .1 包被抗原 根据滴定的最适工作浓度,将两种抗原分别用包被液稀释,两种抗原隔行包被,每孔包被抗原 1 0 0p L ,置3 7 ℃1h 后在4 ℃过夜。 6 .1 .2 用洗涤液洗3 次,每次5r a i n ,叩干。 6 .1 .3 加样 待检血清用稀释液做l 4 0 稀释,分别加人两孔 泰泽病原体抗原孔和阴性对照抗原孔 ,每一抗原 板至少设置两份阳性血清和阴性血清对照。每孔加人稀释后的待检血清、对照血清l O Op L ,3 7 ℃1h , 洗涤同上。 6 .1 .4 加酶结合物 用稀释液将酶结合物稀释成适当浓度,每孔1 0 0t l L ,3 7 ℃1h ,洗涤同上。 6 .1 .5 加底物溶液 每孔加入新配制的底物溶液1 0 0t L L ,置3 7 ℃,避光显色1 0m i n ~1 5m i n 。 6 .1 .6 终止反应 每i L 加入终止液1 0 0p L 。 6 .1 .7 测A 值 在酶标仪上,于4 9 0n m 处读出各孔A 值。 6 .1 .8 结果判定 在阴性和阳性对照成立的情况下,进行结果判定。 6 .1 .8 .1 同时符合下列3 个条件者,判为阳性。对阳性结果需重试,如仍为阳性则判为阳性 a 待检血清与阴性对照抗原和泰泽病原体抗原反应有明显的颜色区别; b 待检血清与泰泽病原体抗原反应的A 值大于等于0 .2 ; c 待检血清与泰泽病原体抗原反应的A 值/阴性对照血清与泰泽病原体抗原反应的A 值大于等 于2 .1 。 2 G B /T1 4 9 2 6 .1 0 2 0 0 8 6 .1 .8 .2 均不符合上述3 个条件者,判为阴性。 6 .1 .8 .3 仅有1 条~2 条符合者,判为可疑,需重试。 6 .2 免疫荧光试验 I F A 6 .2 .1 取出抗原片,室温干燥后,将适当稀释的待检血清 推荐1 1 0 和阴性、阳性血清分别滴于抗原 片上,每张玻片上应分别有阳性和阴性血清各l 孔,置湿盒内,3 7 ℃3 0m i n ~4 5m i n 。 6 .2 .2P B S 洗3 次,每次5r a i n ,室温干燥。 6 .2 .3 取适当的荧光结合物,滴加于抗原片上,置湿盒内,3 7 ℃3 0m i n ~4 5m i n 。 6 .2 .4P B S 洗3 次,每次5r a i n 。 6 .2 .5 玻片用蒸馏水漂洗1 次。 6 .2 .65 0 %甘油P B S 封片,荧光显微镜下观察结果。 6 .2 .7 结果判定阳性血清孔菌体呈强的荧光着色,而阴性对照无荧光或仅有微弱非特异荧光时进行 结果判定。待检血清孔较阴性血清孔菌体荧光着色强,即可判断为阳性反应。 7 结果报告 对血清抗体阳性者作血清抗体检测阳性报告,否则作阴性报告。
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