• 中国内地6所高校跻身世界大学声誉排行榜百强  2019-06-29
  • 混战再起,专车补贴难再现 2019-06-14
  • 如何制订企业发展计划 2019-06-10
  • 贸易保护主义相关新闻 2019-06-10
  • 塔里木油田:沙漠深处谱写科技生态篇章 2019-06-09
  • 李克强在宁夏考察时强调 让“互联网+”更多惠及重点民生领域 2019-06-08
  • 全国京东大鼓星火日活动举行 2019-06-07
  • 凰家街采:你期待的长江时代 ——凤凰网房产武汉 2019-06-06
  • “香会”,中国代表团驳斥美防长言论 2019-06-06
  • 杨超马可谦《你才是美猴王》刷爆朋友圈 2019-06-05
  • 中共中央直属机关党校 2019-06-04
  • 事件 —频道 春城壹网 七彩云南 一网天下 2019-06-04
  • 悬崖边舔盐晒太阳 围观萌系斑羚的日常 2019-06-03
  • 一语惊坛(6月1日):特朗普对欧美盟友发动贸易战! 2019-06-02
  • 王国志:不断凝聚信仰的力量brspan style=font-family 楷体, 楷体 2019-06-02

    河南快赢481电子走势图: GBT14926.21-2008实验动物兔出血症病毒检测方法.rarGBT14926.21-2008实验动物兔出血症病毒检测方法.rar

    河南快赢481下载 www.vqtxh.tw 收藏

    压缩包内文档预览:
    I C S6 5 .0 2 0 .3 0 B4 4 园宜 中华人民共和国国家标准 G B /T 14 9 2 6 .21 2 0 0 8 代替G B /T1 4 9 2 6 .2 1 2 0 0 1 实验动物兔出血症病毒检测方法 L a b o r a t o r ya n i m a l - - M e t h o df o re x a m i n a t i o no fR a b b i t h e m o r r h a g i cd i s e a s ev i r u s R H D V 2 0 0 8 1 2 1 0 发布 2 0 0 9 0 3 - 01 实施 丰瞀嬲紫瓣訾糌瞥星发布中国国家标准化管理委员会仪1 9 刖昂 G B /T1 4 9 2 6 .2 卜一2 0 0 8 G B /T1 4 9 2 6 实验动物共5 4 个部分,为不同微生物和病毒检测技术方法。 本部分自实施之日起代替G B /T1 4 9 2 6 .2 1 2 0 0 1 实验动物兔出血症病毒检测方法。 本部分与G B /T1 4 9 2 6 .2 l 一2 0 0 l 相比主要技术差异如下 a 增加兔出血症病毒核酸 R H D V 核酸检测方法; b 确定兔免疫接种R H D V 疫苗后的血清抗体合格判定标准。 本部分由全国实验动物标准化委员会提出并归口。 本部分起草单位全国实验动物标准化技术委员会。 本部分主要起草人贺争鸣、付瑞、田克恭。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为 G B /T1 4 9 2 6 .2 11 9 9 4 ,G B /T1 4 9 2 6 .2 12 0 0 1 。 实验动物兔出血症病毒检测方法 1 范围 G B /T1 4 9 2 6 的本部分规定了兔出血症病毒 R H D V 的检测方法。 本部分适用于兔R H D V 抗原、抗体和病毒核酸的检测。 2 规范性引用文件 G B /T1 4 9 2 6 .2 1 2 0 0 8 下列文件中的条款通过G B /T1 4 9 2 6 的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文 件,其随后所有的修改单 不包括勘误的内容 或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本 部分。 G B /T1 4 9 2 6 .5 3 实验动物血凝试验 G B /T1 4 9 2 6 .5 4 实验动物血凝抑制试验 3 原理 血凝试验 H A 在一定条件下,R H D V 能凝集人“O ”型红细胞,产生可见的凝集反应。根据这一 特性检测兔肝组织中有无R H D V 抗原。 血凝抑制试验 H A I 在一定条件下,R H D V 凝集人“o ”型红细胞的能力可被特异性抗体所抑制。 根据这一特性检测兔血清中有无R H D V 抗体。 核酸检测根据R H D V V P 6 0 基因序列保守的特点,设计特异引物,扩增目的片段,检测兔组织中 的R H D V 核酸。 4 主要试剂与器材 4 .1 试剂 4 .1 .1 血凝素 人工感染或自然发病的兔肝组织,经研磨制成1 0 %悬液,30 0 0r /m i n 离心1 0m i n 而获得的上 清液。 4 .1 .2 阳性血清 R H D V 抗原免疫或R H D V 自然感染恢复后的兔血清。 4 .1 .3 阴性血清 无R H D V 感染、未经免疫的兔血清。 4 .1 .4 人“0 ”型红细胞。 4 .1 .5 缓冲液与溶液 4 .1 .5 .1 P B S p H 7 .4 N a C l8g K C l0 .2g N a 2 H P 0 4 ·1 2 H 2 0 2 .8 3g K H z P O t 0 .2g 去离子水 10 0 0m L 4 .1 .5 .2T R I z o lR e a g e n t 。 1 G B /T1 4 9 2 5 .2 1 2 0 0 8 4 .1 .5 .35 0 T A EB u f f e r p H 8 .5 T r i s2 4 2g 醋酸 5 7 .1m L N a z E D T A ·2 H 2 0 3 7 .2g 去离子水 10 0 0m L 5 .4 溴乙锭 1 0m g /m L 。 5 .5 6 L o d i n gB u f f e r 。 5 .6 氨苄青霉素 1 0 0m g /m L 。 5 .7 三氯甲烷 分析纯 。 5 .8 乙醇 分析纯 。 5 .9 异丙醇 分析纯 。 6 酶与缓冲液 6 .15 A M VR TB u f f e r ,A M VR T a s e 1 0U /p L 。 6 .2R N a s ei n h i b i t o r 4 0U /u L 。 6 .3 D E P 、_ H O 。 6 .4 随机引物9 m e r s 5 0 0p g /m L 。 6 .5 d N T Pm i x t u r e 2 .5m m o l /Le a c h 。 6 .6 M g C l 2 2 5m m o l /L ,1 0 P C RB u f f e r ,T a qD N Ap o l y m e r a s e 5U /p L 。 7 培养基 7 .1 L B 培养基 t r y p t o n e 1 0g y e a s te x t r a c t 5g N a C l1 0g 去离子水 10 0 0m L 4 .1 .7 .2 L B /A m p t r y p t o n e 1 0g y e a s te x t r a c t 5g N a C I 1 0g a m p i c i l l i n 1 0 0p g /m L 去离子水 10 0 0m L 4 .1 .8 琼脂糖凝胶A g a r o s eL 0 3 。 4 .1 .9 感受态细胞与载体 4 .1 .9 .1 适用于所构建克隆载体的大肠杆菌感受态细胞。 4 .1 .9 .2D N A 片段琼脂糖凝胶纯化试剂盒。 4 .1 .9 .3 可用于连接P C R 产物的商品化T 载体。 4 .1 .9 .4 质粒小量提取试剂盒。 4 .2 器材 4 .2 .1 微量振荡器。 4 .2 .2 微量血凝反应板 u 型或V 型 。 4 .2 .3 微量加样器 容量0 .5p L ~1 0f f L ,1 0f f L ~1 0 0 弘L ,2 0t z L ~2 0 0p - L ,i 0 0 卜L ~l0 0 0p L 。 4 .2 .4 生物安全柜。 4 .2 .5 冷冻离心机。 4 .2 .6 紫外分光光度仪。 2 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 .2 .7 P C R 仪。 4 .2 .8 电泳仪。 4 .2 .9 紫外透射仪。 4 .2 .1 0 恒温培养箱。 4 .2 .1 1 恒温摇床。 4 .2 .1 2 恒温水浴箱。 4 .2 .1 3 超纯水系统。 4 .2 .1 4 冰箱。 G B /T1 4 9 2 6 .2 1 2 0 0 8 5 操作步骤 5 .1 采用H A 方法 见G B /T1 4 9 2 6 .5 3 进行病毒抗原检测。 5 .2 采用H A l 方法 见G B /T1 4 9 2 6 .5 4 进行病毒抗体检测。 5 .3 病毒核酸检测 5 .3 .1 引物设计 根据R H D VF D R 株序列 G e n B a n k 登录号N c - 0 0 1 5 4 3 ,针对V P 6 0 基因区段设计引物。引物在 R H D V 基因组中的位置、核苷酸组成及预期扩增目的基因长度见表1 。 表1R T - P C R 引物 引物 位置序列 产物大小 正向引物P 1 n t6 2 5 4 一n t6 2 7 15 ’一A T G C C A A T G C T G G G 2 、C T 0 3 ’ 3 6 8 b p 反向引物P 2 n t6 6 2 1n t6 6 0 25 ’T T G A G G C G T G T A T G T G A T G G3 , 5 .3 .2R N A 提取 5 .3 .2 .1 在生物安全柜内,取R H D V 感染的兔肝组织5 0m g ~1 0 0m g ,置于灭菌玻璃研磨器中,加 1m I ,灭菌P B S p H7 .4 充分研磨。 5 .3 .2 .2 将肝组织匀浆转移至1 .5m L 洁净离心管中,加入1m LT R f z o lR e a g e n t ,混匀,室温放置 1 0 m i n 。 5 .3 .2 .3 加0 .2m L 三氯甲烷,充分混匀1 0s ,室温放置1 0m i n ,4 ℃1 20 0 0r /m i n 离心1 5m i n 。 5 .3 .2 .4 取上清,加等体积异丙醇,室温2 0m i n ,4 ℃1 20 0 0r /m i n 离心1 5m i n 。 5 .3 .2 .5 弃上清,沉淀以1m L7 5 %乙醇 现用现配 洗涤后,室温干燥至R N A 呈透明膜状。 5 .3 .2 .6 加4 0 p L D E P C - H 。O 溶解R N A 沉淀 ,紫外分光光度仪测定所提取的R N A ,立即进行反转 录 R T 或一7 0 ℃保存。 警告D E P C 对眼睛和气道粘膜有强刺激,在操作中应在通风条件下进行,使用时戴口罩,不小心沾 到手上应立即冲洗。 5 .3 .3 反转录 R T 5 .3 .3 .1 R T 反应体系为2 5p L ,依次加入如下成分5p L5 A M VR TB u f f e r ,5 肛Ld N T Pm i x t u r e 2 .5m m o l /Le a c h ,1p L 随机引物 5 0 0p g /m L ,0 .5p LR N a s ei n h i b i t o r 4 0U /p L ,1 2 .5p LR N A 模版,1p LA M VR T a s e 1 0U /p L 。 5 .3 .3 .2 反转录反应条件为3 7 ℃9 0m i n ,9 5 ℃5m i n ,所得c D N A 可用作P C R 反应模板。 5 .3 .3 .3 每次进行R T 时均设标准阳性、阴性及空白对照。 5 .3 .4R 2 “ - P C R 5 .3 .4 .1 P C R 反应体系为5 0 止,依次加入如下成分5 吐l o XP C RB u f f e r ,2p LM g C l 2 2 5m m o l /L , 2p Ld N T Pm i x t u r e ,1p L 正向引物P 1 5 0p m o l /L ,1p L 反向引物P 2 5 0p m o l /L ,2p Le D N A , 0 .5p LT a qD N Ap o l y m e r a s e 5U /p L ,3 6 .5p Ld d H 2 0 。 G B /T1 4 9 2 6 .2 1 2 0 0 8 5 .3 .4 .2P C R 反应参数为9 5 ℃预变性5m i n ;9 4 ℃1m i n ,5 9 ℃1m i n ,7 2o c1m i n ,共3 0 次循环;最 后一次循环后7 2 ℃再延伸1 0m i n 。 5 .3 .4 .3 每次进行R T - P C R 时均设标准阳性、阴性及空白对照。 5 .3 .5 琼脂糖凝胶电泳 5 .3 .5 .1 配制2 %琼脂糖凝胶 含0 .5 /z g /m L 溴化乙锭 。 5 .3 .5 .2 取P C R 扩增产物8p L ,分别与2p L 的6 载样缓冲液混匀,加到凝胶孔格中。 5 .3 .5 .3 电泳缓冲液为1 T A E 缓冲液,电泳条件为i 0 0V 恒压电泳3 0m i n ~6 0m i n ,紫外透射仪下 观察结果。 5 .3 .6R H D V 基因的克隆、鉴定及序列测定 5 .3 .6 .1 R H D VR T - P C R 和R T - n e s t e dP C R 产物经2 .0 %琼脂糖凝胶电泳后,用洁净锋利的手术刀 切下目的条带,用W i z a r dP C RP r e p sD N AP u r i f i c a t i o nS y s t e m 回收纯化,取1p L 电泳检测。 5 .3 .6 .2 1 0p L 的连接反应体系中依次加入下列成分5p L2 R a p i dL i g a t i o nB u f f e r ,p G E M TE a s y V e c t o r1p L ,回收纯化的P C R 目的片段3p L ,1p LT 4D N AL i g a s e 。连接反应条件为室温1h ,4 ℃ 1 2h 。 5 .3 .6 .3 取5p L 连接产物转化E .c o l iD H5 a 感受态细胞,然后将转化的菌液均匀涂布于含氨苄青 霉素 1 0 0u g /m L 的L B 平板上,3 7 ℃培养过夜。挑取光滑、圆整的白色菌落,接种于含氨苄青霉素 1 0 0P g /m L 的L B 液体培养基,3 7 ℃2 0 0r /m i n 摇振培养6h ,然后用质粒小量提取试剂盒制备质粒 D N A 供限制性酶切分析,并进行P C R 鉴定。 5 .3 .6 .4 将筛选到的阳性克隆分别送检测单位,以T 7 和S P 6 通用引物,用A B I 测序仪进行序列测定。 测序结果经计算机软件分析与O e n B a n k 中相关序列进行同源性比较。 6 结果判定 6 .1 H A 经研磨制成1 0 %的兔肝上清液,H A 滴度小于等于1 1 6 判为阴性。对阳性 H A 滴度大于 1 1 6 检测结果,选用同一种方法重试,如仍为阳性则判为阳性。 6 .2H A I 6 .2 .1 基础级兔如接种疫苗,H A I 抗体效价大于1 1 0 ,同时免疫抗体合格率[ 被检动物抗体阳性 数/被检动物总数 1 0 0 %] 大于等于7 0 %判定该兔群免疫合格。 6 .2 .2 清洁级兔、S P F 兔H A I 抗体效价小于等于1 1 0 判为阴性;对阳性 H A I 抗体效价大于 1 1 0 检测结果,选用同一种方法重试,如为阳性则判为阳性。 6 .3R T - P C R 每个样本均进行两次试验检测,以标准M a r k e r 及阳性对照为基准,在3 6 8b p 处见到电泳条带并测 序结果正确者为阳性。 7 结果报告 根据判定结果,作出报告。
    编号:20190623225620119    类型:共享资源    大?。?span class="font-tahoma">116.97KB    格式:RAR    上传时间:2019-06-23
      
    3
    关 键 词:
    14926.21-2008 兔出血症病毒检测方法 2008实验动物兔出血症病毒检测方法 14926.21
    资源描述:
    GBT14926.21-2008实验动物兔出血症病毒检测方法.rar,14926.21-2008,兔出血症病毒检测方法,2008实验动物兔出血症病毒检测方法,14926.21
      人人文库网所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
    关于本文
    本文标题:GBT14926.21-2008实验动物兔出血症病毒检测方法.rar
    链接地址://www.vqtxh.tw/p-20190037.html

    当前资源信息

    4.0
     
    (2人评价)
    浏览:6次
    hon****an上传于2019-06-23

    官方联系方式

    客服手机:17625900360   
    2:不支持迅雷下载,请使用浏览器下载   
    3:不支持QQ浏览器下载,请用其他浏览器   
    4:下载后的文档和图纸-无水印   
    5:文档经过压缩,下载后原文更清晰   

    精品推荐

    相关阅读

    关于我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - 网站客服 - 河南快赢481下载

    网站客服QQ:2846424093    人人文库上传用户QQ群:460291265   

    [email protected] 2016-2018  www.vqtxh.tw 网站版权所有   

    备案号:苏ICP备12009002号-5 


  • 中国内地6所高校跻身世界大学声誉排行榜百强  2019-06-29
  • 混战再起,专车补贴难再现 2019-06-14
  • 如何制订企业发展计划 2019-06-10
  • 贸易保护主义相关新闻 2019-06-10
  • 塔里木油田:沙漠深处谱写科技生态篇章 2019-06-09
  • 李克强在宁夏考察时强调 让“互联网+”更多惠及重点民生领域 2019-06-08
  • 全国京东大鼓星火日活动举行 2019-06-07
  • 凰家街采:你期待的长江时代 ——凤凰网房产武汉 2019-06-06
  • “香会”,中国代表团驳斥美防长言论 2019-06-06
  • 杨超马可谦《你才是美猴王》刷爆朋友圈 2019-06-05
  • 中共中央直属机关党校 2019-06-04
  • 事件 —频道 春城壹网 七彩云南 一网天下 2019-06-04
  • 悬崖边舔盐晒太阳 围观萌系斑羚的日常 2019-06-03
  • 一语惊坛(6月1日):特朗普对欧美盟友发动贸易战! 2019-06-02
  • 王国志:不断凝聚信仰的力量brspan style=font-family 楷体, 楷体 2019-06-02
  • 黄金农场怎么玩 中国 网球冠军 拜仁慕尼黑2018 暗恋注册 牛牛水果大餐 陕西快乐十分派彩电子走势图 上海上港虎扑 时时彩直播视频直播 淘金疯狂返水 北京时时彩计划群