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    I C S6 5 .0 2 0 .3 0 B4 4 囝宦 中华人民共和国国家标准 G B /T14 9 2 6 .4 6 2 0 0 8 代替G B /T1 4 9 2 6 .4 6 2 0 0 1 实验动物钩端螺旋体检测方法 L a b o r a t o r ya n i m a l - - M e t h o df o re x a m i n a t i o no fL e p t o s p i r as p p . 2 0 0 8 - 1 2 - 0 3 发布2 0 0 9 0 3 0 1 实施 宰瞀粥紫瓣警矬瞥星发布中国国家标准化管理委员会议1 9 刖罱 G B /T1 4 9 2 6 .4 6 2 0 0 8 G B /T1 4 9 2 6 实验动物共5 4 个部分,为不同微生物和病毒检测技术方法。 本部分自实施之日起代替G B /T1 4 9 2 6 .4 6 2 0 0 1 实验动物钩端螺旋体检测方法。 本部分与G B /T1 4 9 2 6 .4 6 2 0 0 l 相比主要技术差异如下 a 原理部分增加显微镜凝集试验原理; b 原标准中“6 .1 试管凝集实验”修改为“显微镜凝集实验”;“6 .1 .2 .2 表1 钩端螺旋体定量 显凝试验操作方法”更改为“钩端螺旋体定量显微镜凝集试验操作方法”; c 修改原标准中所有关于酶联免疫吸附试验的内容; d 在原标准中增加了“7 结果判定”。 本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归口。 本部分由全国实验动物标准化技术委员会负责起草。 本部分主要起草人范薇、田克恭、贺争鸣。 本部分所代替标准历次版本发布情况为 G B /T1 4 9 2 6 .4 6 2 0 0 1 。 实验动物钩端螺旋体检测方法 G B /T 14 9 2 6 .4 6 2 0 0 8 1 范围 G B /T1 4 9 2 6 的本部分规定了实验动物钩端螺旋体的检测方法。 本部分适用于犬钩端螺旋体的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过G B /T1 4 9 2 6 的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文 件,其随后所有的修改单 不包括勘误的内容 或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本 部分。 G B /T1 4 9 2 6 .4 2 实验动物细菌学检测标本采集 G B /T1 4 9 2 6 .4 3 实验动物细菌学检测 染色法、培养基和试剂 G B /T1 4 9 2 6 .5 0 实验动物酶联免疫吸附试验 3 原理 钩端螺旋体抗原与相应特异性抗体相遇,在适宜的电解质存在下发生凝集现象,此种凝集一般须用 暗视野显微镜检查。 钩端螺旋体抗原与待检血清中的特异性抗体结合,形成抗原抗体复合物。此抗原抗体复合物仍保 持其抗原活性,可与相应的第二抗体酶结合物结合。在酶的催化作用下底物发生反应,产生有色物质。 颜色反应的深浅与待检血清中所含有的特异性抗体的量成正比。 4 主要设备和材料 4 .1 普通恒温培养箱。 4 .2 实体显微镜。 4 .3 恒温水浴箱。 4 .4 高速离心机。 4 .5 超声波细胞粉碎器。 4 .6 酶标仪。 4 .7 微量加样器,容量5p L ~5 0p L 和5 0p L y 2 0 0p L 。 5 培养基及试剂 5 .1 犬型钩端螺旋体标准抗原。 5 .2 标准阳性血清。 5 .3 标准阴性血清。 5 .4 生理盐水。 5 .5 显微镜凝集抗原各群钩端螺旋体标准株接种K o r t h o f 培养基,2 8 ℃培养5d ~7d 。取样作暗视 野显微镜检查,每4 0 0 倍视野不少于5 0 条,运动活泼并无自凝现象者,可作为抗原。 5 .6E L I S A 抗原 5 .6 .1 钩端螺旋体培养各群钩端螺旋体标准株接种K o r t h o f 培养基,2 8 ℃培养5d ~7d 。 】 G B /T1 4 9 2 6 .4 6 2 0 0 8 5 .6 .2 生长良好的培养物用1 00 0 0r /m i n 离心3 0m i n ,沉淀用P B S 在相同条件下洗2 次。 5 .6 .3 上述沉淀用P B S 悬浮,超声波打碎后,1 00 0 0r /m i n 离心2 0 r a i n ,上清即为E L I S A 抗原。 5 .7 酶结合物辣根过氧化物酶标记羊或兔抗犬I g G 抗体,辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白A S P A 。 5 .8 阳性血清钩端螺旋体免疫S P F 犬所获得的血清,或自然感染犬后所获得的血清。 5 .9 阴性血清无钩端螺旋体感染犬血清。 5 .1 0 培养基和试剂溶液的配制参照G B /T1 4 9 2 6 .4 3 和G B /T1 4 9 2 6 .5 0 执行。 6 检测方法 6 .1 显微镜凝集实验 6 .1 .1 检测程序 检测程序见图1 。 图1 检测程序 6 .1 .2 操作步骤 6 .1 .2 .1 采样 采血、分离血清。采样方法参照G B /T1 4 9 2 6 .4 2 执行。 6 .1 .2 .2 血清稀释 参照表1 进行。 表1钩端螺旋体定量显微镜凝集试验操作方法 凹孔板编号 12 345 67891 01 l1 2 生理盐水/m L 0 .1 60 .1O .10 .10 .10 .10 .10 .10 .10 .1 待检血清/m L 0 .0 4 /0 .1 夕0 .1 夕0 .1 ,0 .1 夕0 .1 夕0 .1 /0 .1 夕0 .1 ≯弃去 0 .1 阴性血清/m L 0 .1 阳性血清/m L 0 .1 标准抗原/m L0 .10 .10 .10 .10 .1 0 .10 .1010 .10 .10 .1O .1 血清最终稀释度1 /1 01 /Z 01 /4 01 /8 01 /1 6 0 1 /3 2 0l /6 4 01 /12 8 01 /Z5 6 0 G B /T1 4 9 2 6 .4 6 2 0 0 8 6 .1 .2 .2 .1 待检血清灭活将待检血清以5 6 ℃水浴灭活3 0r a i n 后备用。 6 .1 .2 .2 .2 取9 6 孔板,第1 孔加人生理盐水0 .1 6m L ,以后每孔加入生理盐水0 .1m L ,一直加到 第9 孔。 6 .1 .2 .2 .3 在第1 孔中加入血清0 .0 4m L ,混匀后,吸取o .1m L 到第2 孔,如此类推,直到第9 孔,弃 去0 .1 m L 。 6 .1 .2 .3 对照 另标明1 0 、1 1 、1 2 孔,第1 0 孔加人阴性血清0 .1m L ,第1 1 孔加入阳性血清0 .1m L ,第1 2 孔加人 生理盐水0 .1m L 。 6 .1 .2 .4 加入抗原 将各孔加入标准抗原0 .1m L ,混匀,此时各孔血清稀释度为1 1 0 ,1 2 0 ,1 4 0 ,1 8 0 ,1 1 6 0 , 1 3 2 0 ,1 6 4 0 ,1 12 8 0 ,1 25 6 0 。具体操作见表1 。置3 7 ℃温箱2h ,取出后摇匀,用接种环挑取 各孔中的反应物置于载玻片上,在暗视野下观察结果。 6 .1 .2 .5 结果判定 结果判定如下 a 几乎全部钩端螺旋体呈蝌蚪状或折光率高的团块,或有大小不等的点状或块状残 片,仅有少数游离的钩端螺旋体; b 7 5 %的钩端螺旋体被凝集,大部分呈块状或蜘蛛状,尚有2 5 %菌体游离; c 5 0 %左右的钩端螺旋体被凝集,尚有5 0 %菌体游离; d 2 5 %左右的钩端螺旋体被凝集,尚有7 5 %菌体游离; e 一全部菌体正常,分散,无凝集块,菌数与对照相同。 待检血清凝集效价在1 2 0 达到“ ”或以上时,均判为阳性反应。 6 .2 酶联免疫吸附试验 E L I S A 6 .2 .1 包被抗原 根据滴定的最适工作浓度,将抗原用包被液稀释。每孔1 0 0p L ,置3 7 ℃1h 后再4 ℃过夜。 6 .2 .2 用洗涤液洗3 次,每次5r a i n ,叩干。 6 .2 .3 加样 待检血清和阴性、阳性血清分别用稀释液做1 1 6 0 稀释,每孔1 0 0p L ,3 7 ℃1h ,洗涤同上。 6 .2 .4 加酶结合物 用稀释液将酶结合物稀释至适当浓度,每孔加入1 0 0p L ,3 7 ℃1h ,洗涤同上。 6 .2 .5 加底物溶液 每孔加入新配制的底物溶液1 0 0p L ,置3 7 ℃,避光显色1 0m i n ~1 5m i n 。 6 .2 .6 终止反应 每孔加人终止液5 0 “L 。 6 .2 .7 测A 值 在酶标仪上,于4 9 0n m 处读出各孔A 值。 6 .2 .8 结果判定 在阴性和阳性血清对照成立的条件下,进行结果判定。 6 .2 .8 .1 同时符合下列2 个条件者,判为阳性 a 待检血清的A 值大于等于0 .2 ; b 待检血清的A 值/阴性对照血清的A 值大于等于2 .1 。 6 .2 .8 .2 均不符合上述2 个条件者,判为阴性。 6 .2 .8 .3 仅有1 条符合者,判为可疑,需重试。如仍为阳性则判为阳性。 6 .2 .8 .4 对阳性结果需重试,如仍为阳性则判为阳性。 G B /T1 4 9 2 6 .4 6 2 0 0 8 7 结果判定 7 .1 基础级犬 如接种疫苗后,经E L I S A 检测抗体效价大于等于1 1 6 0 ,或显微镜凝集检测抗体效价大于等于 1 2 0 判为合格。被检动物免疫抗体合格率大于等于7 0 %可判为该犬群免疫合格。 免疫抗体合格率一 被检动物抗体阳性数/被检动物总数 X 1 0 0 % 7 .2S P F 级犬 不应进行疫苗接种,或未进行免疫的基础级犬,对阳性检测结果,选用同一种方法或另一种方法重 试。如仍为阳性则判为阳性。 8 结果报告 根据判定结果,作出报告。
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