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    I C S6 5 .0 2 0 .3 0 B4 4 雪 中华人民共和国国家标准 G B /T14 9 2 7 .2 2 0 0 8 代替G B /T1 4 9 2 7 .2 2 0 0 1 实验动物 近交系小鼠、大鼠免疫标记检测法 2 0 0 8 - 1 2 - 1 0 发布 L a b o r a t o r ya n i m a l I m m u n o l o g i c a lm a r k e ro fi n b r e dm i c ea n dr a t s 2 0 0 9 - 0 3 - 01 实施 宰瞀髁鬻瓣訾糍瞥霎发布中国国家标准化管理委员会仪1 9 法。 刖菁 G B /T1 4 9 2 7 .2 2 0 0 8 G B /T1 4 9 2 7 共分2 个部分 第1 部分为实验动物近交系小鼠、大鼠生化标记检测法; 第2 部分为实验动物近交系小鼠、大鼠免疫标记检测法。 本部分为G B /T1 4 9 2 7 的第2 部分。 本部分自实施之日起,代替G B /T1 4 9 2 7 .22 0 0 1 实验动物近交系小鼠、大鼠皮肤移植检测 本部分与G B /T1 4 9 2 7 .2 - - 2 0 0 1 相比主要技术差异如下 a 修订实验动物近交系小鼠、大鼠皮肤移植法部分内容; b 增加小鼠H2 单倍型微量细胞毒检测法; c 本部分名称修改为“实验动物近交系小鼠、大鼠免疫标记检测法”。 本部分附录A 为资料性附录。 本部分由全国实验动物标准化技术委员会提出并归口。 本部分由全国实验动物标准化技术委员会负责起草。 本部分主要起草人邢瑞昌、刘双环、马丽颖、岳秉飞、鲍世民。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为 G B /T1 4 9 2 7 .21 9 9 4 ,G B /T1 4 9 2 7 .2 2 0 0 1 。 实验动物 近交系小鼠、大鼠免疫标记检测法 G B /T1 4 9 2 7 .2 2 0 0 8 1 范围 G B /T1 4 9 2 7 的本部分规定了近交系小鼠、大鼠皮肤移植术法和近交系小鼠H 一2 单倍型 H a p l o t y p e 检测方法。 本部分近交系小鼠、大鼠皮肤移植术法适用于近交系小鼠和大鼠在培育过程中遗传纯度的检查以 及近交系小鼠和大鼠在繁殖饲养过程中的遗传监测。近交系小鼠H 一2 单倍型 H a p l o t y p e 检测方法适 用于近交系小鼠培育和繁殖饲养过程中的遗传监测,主要检测H2 复合体D 区和K 区的抗原分型。 2 近交系小鼠和大鼠皮肤移植术法 2 .1 技术原理 移植物在同一近交系中可以被互相接受,即同系移植 i s o g r a f t 是成功的。 移植物在不同近交系中互相排斥,亦即同种移植 a l l o g r a f t 是不成功的。 F 1 代动物可以接受任何一个双亲的组织移植物,双亲则不能接受F 1 代的移植物。 F l 代动物可以接受F 2 代以后各代动物的移植物。 亲本品系可以接受某些F 2 代以后各代动物的移植物。但是绝大部分被排斥。 本部分采用背部皮肤移植法和尾部皮肤移植法。两种方法原理相同,并具有同等标准效力。 2 .2 背部皮肤移植法 2 .2 .t 设备和材料 2 .2 .1 .1 固定板 1 8c m 1 2c m 。 2 .2 .1 .2 戊巴比妥钠 医用 。 2 .2 .1 .3 医用橡皮膏。 2 .2 .1 .4 医用凡士林。 2 .2 .1 .5 粉剂青霉素G 钠 8 0 万u ,人或兽用 。 2 .2 .1 .63 %碘酒棉球。 2 .2 .1 .7 7 5 %酒精棉球。 2 .2 .1 .8 眼科剪刀。 2 .2 .1 .9 眼科镊子。 2 .2 .1 .1 0 一次性注射器 1m L 。 2 .2 .1 .1 1 纱布 剪成4 0m m 长,2 5m m 宽若干条;厚2 层~3 层若干块,其上涂医用凡士林及粉剂青 霉素G 钠 。 2 .2 .1 .1 2 脱脂棉做成的棉球。 2 .2 .1 .1 3 将手术器材置于高压锅内1 2 1 ℃、4 0m i n 高压灭菌。 2 .2 .2 操作步骤 2 .2 .2 .1 随机取同性别4 周龄~8 周龄的动物1 0 只,动物可来自基础群或血缘扩大群。 2 .2 .2 .2 每只动物分别编号并称取体重,详细记录品系名称、性别、出生年月日、谱系及其他特征。 2 .2 .2 .3 用无菌生理盐水配制0 .7 %戊巴比妥钠溶液。 2 .2 .2 .4 采用腹腔注射0 .7 %戊巴比妥钠溶液麻醉动物。小鼠每1 0g 体重注射0 .1m L ,大鼠每2 0g 1 G B /T1 4 9 2 7 .2 2 0 0 8 体重注射0 .1m L 。因不同品系动物对麻醉剂敏感性不同,注射量可适当增减 手术时室温应控制在 2 5 ℃~2 8 ℃之间 。 2 .2 .2 .5 待动物麻醉失去知觉后,将其背部朝上放在固定板上,固定动物,剪去被毛,并用3 %碘酒棉 球和7 5 %酒精棉球消毒。 2 .2 .2 .6 在背部剪下直径5m m ~1 0m m 的皮肤左右各一块 其中一块用做自体移植,另一块用做异 体移植 。 2 .2 .2 .7 将剪好的皮片翻转过来放人带少量生理盐水的双碟 直径为6c m 中,用眼科剪刀,轻轻地切 去皮下组织至真皮,然后放在无菌生理盐水中冲洗一下。 2 .2 .2 .8 两只动物的皮片,除左侧皮片做自体移植外,右侧皮片循环交换,逆毛方向移植并使之吻合。 2 .2 .2 .9 覆盖涂过凡士林和青霉素G 钠的纱布块,3 层~4 层,用1c m 宽橡皮膏固定,松紧适度。 2 .2 .2 .1 0 手术结束待动物苏醒后,把动物放入鼠盒内,并挂上标记卡片,1 0d 后拆除包扎。 2 .2 .3 结果观察 2 .2 .3 .1 拆包后,发现皮片干瘪、脱落则为技术失败。如皮片脱痂,手术部位平整、一周后有新毛长出 则为手术成功。对照自体移植,技术失败率不得大于1 0 %。 2 .2 .3 .2 如果皮片在2 周~3 周内脱落,则为急性排斥。遗传污染通常引起急性排斥。 2 .2 .3 .3 如果皮片在3 周脱落,则为慢性排斥。移植物有否慢性排斥至少观察1 0 0d ,遗传突变通常引 起慢性排斥。 2 .2 .3 .4 如果对结果怀疑,则要进行重新移植,可以使用一批新的动物,也可以使用已做过移植但对结 果产生怀疑的动物。如果是后者,则排斥更迅速、更典型。 2 .3 尾部皮肤移植法 2 .3 .1 设备和材料 2 .3 .1 .1 1 1 号手术刀柄。 2 .3 .1 .2 1 l 号手术尖刀片。 2 .3 .1 .3 玻璃套管 直径8r f l r f l ,大鼠可适当大些 。 2 .3 .1 .4 其他材料见2 .2 .1 。 2 .3 .2 操作步骤 2 .3 .2 .1 随机取同性别4 周龄- - 8 周龄的动物1 0 只,动物可来自于基础群、血缘扩大群或生产群。 2 .3 .2 .2 每只动物分别编号并称取体重,详细记录品系名称、性别、出生年月日、谱系及其他特征。 2 .3 .2 .3 用无菌生理盐水配制0 .7 %戊巴比妥钠溶液。 2 .3 .2 .4 采用腹腔注射麻醉0 .7 %戊巴比妥钠溶液动物,小鼠每1 0g 体重注射o .1m L ,大鼠每2 0g 体重注射0 .1m L 。因不同品系动物对麻醉剂敏感性不同,注射量可适当增减 手术时室温应控制在 2 5 ℃~2 8 ℃之间 。 2 .3 .2 .5 待动物麻醉失去知觉后,将5 只一组按顺序采取仰卧式放在一块滤纸上,并用3 %碘酒棉球 和7 5 %酒精棉球消毒鼠尾。 2 .3 .2 .6 用左手食指按住动物尾根,左手拇指按住尾尖,固定鼠尾并使其微微伸展,然后右手持解剖 刀,刃面朝上,与尾部皮肤成2 0 ?!? 0 。夹角,在尾静脉上部或两条尾静脉之间,在离尾部5m m 处削下一 片宽约2m m ~3m m ,长约7m m ~8m m 的皮肤,其厚度前者以没有严重出血,后者能足以暴露出白色 的肌腱但又不割伤血管为宜。 2 .3 .2 .7 右手将刀片逆时针方向交给左手,附着在刀片上的皮片相应转1 8 0 。,将皮片用眼科镊子取下 贴在原创面上,并尽量使其吻合,用一小片滤纸覆盖,再轻轻按压一下,然后取掉滤纸片,该移植作为自 体移植对照。 2 .3 .2 .8 按照2 .3 .2 .6 和2 .3 .2 .7 步骤,完成另4 只动物的自体移植对照。 2 .3 .2 .9 按照2 .3 .2 .6 和2 .3 .2 .7 步骤,参照皮肤移植相互循环系统图示,进行循环皮肤移植。亦即 2 前边鼠的第三片皮和后边相邻鼠的第二片皮进行相互交换植皮,具体操作见图1 。 .Z G B /T1 4 9 2 7 .2 2 0 0 8 注A 表示自体移植对照;圆圈中的阿拉伯数字表示编号小鼠供体的皮片。 图1皮肤移植相互循环系统 2 .3 .2 .1 0 取五支玻璃套管,分别轻轻套入动物尾巴至根部3m m 处,用医用胶布在尾巴远端靠近套管 处将尾巴粘住,胶布往返粘贴2 圈~3 圈,使套管可做轻微上下活动但不脱落。 2 .3 .2 .11 套好玻璃管后,用落地手术灯照射动物大约1 5m i n ~3 0r a i n 。然后将动物仰躺着放入鼠盒 中挂上标记卡片。 2 .3 .2 .1 2 2 4h 后取下套管,此时可看到皮片已粘在创面上。 2 .3 .3 结果观察 2 .3 .3 .1 皮片在第一周内苍白、干瘪、脱落,则为技术失败。对照自体移植,技术失败率不得大 于1 0 %。 2 .3 .3 .2 皮片在第2 周至第3 周内发炎、水肿、坏死、结痂直至脱落,则为急性排斥。遗传污染通常引 起急性排斥。 2 .3 .3 .3 皮片在第3 周至第9 周内逆毛逐渐脱落,直至无毛;或者因排斥留下凹陷疤痕,都为慢性排 斥。遗传突变通常引起慢性排斥。 2 .3 .3 .4 皮片在1 0 0d 的观察期内,始终有逆毛,则为永久接受的标志。 2 .3 .3 .5 如果对结果有怀疑,则要进行重新移植,以得出明确结果。 3 近交系小鼠H - 2 单倍型检测方法微量细胞毒法 3 .1 技术原理 在免疫遗传学中,能引起强烈移植排斥反应的抗原系统称为主要组织相容性抗原系统。小鼠的主 要组织相容性原系统称为H 一2 复合体 m a j o rh i s t o c 。m p a t i b i l i t yc o m p l e x ,H 一2c o m p l e x ,是定位于第 1 7 号染色体上的一个区段。不同品系的近交系小鼠,其H 一2 复合体组成不同,表现在H 一2 单倍型的不 同。H 之单倍型可以通过抗原抗体反应进行判别。 单克隆抗体能够特异性地与抗原进行反应,具有专一性,能够识别出对应的抗原物。利用H2 复 合体D 区和K 区所对应的单抗,通过微量细胞毒法可以判定D 区和K 区的类型。 3 .2 设备与材料 3 .2 .1 单克隆抗体 纯化非标记的单克隆抗体H 一2 D b 2 7 1 卜1 3 、H 一2 D d 3 4 58 S 、H 一2 D k 1 5 - 5 5 .3 、H 一2 K k 1 6 3 .2 2 .4 。 3 .2 .2 小牛血清。 3 .2 .3 补体制备 2 周龄~3 周龄新西兰仔兔,取动脉血,4 ℃冰箱静置1 2h ,30 0 0r /m i n 离心1 5m i n 分离血清,筛选 不致小鼠脾细胞死亡的兔血清,分装,7 0 ℃低温冰箱保存。 3 / G B /T1 4 9 2 7 .2 2 0 0 8 3 .2 .4 P B Sp H 7 .2 N a z H P 0 4 ·1 2 H 2 0 K H P 0 4 N a C I 蒸馏水 3 .2 .5 H a n k ’s 液 N a C l M g S O ?!? H 2 0 K C l K H 2 P 0 4 N a H C 0 3 葡萄糖 蒸馏水 3 .2 .6 伊红染色液 6 % 曙红B 水溶性 E o s i nB 蒸馏水 3 .2 .7 甲醛溶液 1 0 % 1 .2 7g 0 .2 1g 3 .4 0g 至5 0 0 m L 8 .0 0g 0 .4 1g 0 .4 0g 0 .1 0g 1 .2 7g 2 .0 0g 至1 0 0 m L 0 .6g 至1 0 m L 甲醛 1m L 蒸馏水 至1 0m L 3 .2 .8 离心机5 0 0r /m i n ~40 0 0r /r a i n 离心机。 3 .2 .9 倒置显微镜低倍。 3 .2 .1 03 7 ℃恒温水浴箱。 3 .3 操作 3 .3 .1 脾细胞的制备 3 .3 .1 .1 取待检小鼠脾剥去脂肪等附着物。 3 。3 .1 .2 置于盛有1m L1 0 %小牛血清 9m LP B S ,1m L 小牛血清 的平皿中,用小镊子撕碎。 3 .3 .1 .3 将此混合物转移至离心管中,再用1m L1 0 M 小牛血清清洗平皿转移至同一离心管中,静置 1 5r a i n 。 3 .3 .1 .4 吸上清于另一离心管中,弃去沉淀。 3 .3 .1 .5 离心上清液,30 0 0r /m i n 离心5r a i n 。 3 .3 .1 .6 弃掉上清液,保留沉淀。在沉淀中加入4 .5m L 蒸馏水用吸管充分吸打搅匀,从加入蒸馏水 时严格计时,4 0s 后加入0 .5m LH a n k ’S 液,用吸管充分吸打搅匀,静置1 0r a i n 。 3 .3 .1 .7 吸上清于另一离心管中,弃掉下部沉淀团块,离- t _ , a k 清液,30 0 0r /r a i n 离心5m i n 。 3 .3 .1 .8 弃掉上清液,保留沉淀。在沉淀中加入0 .5m L2 0 %小牛血清 8m LP B S ,2m L 小牛血清 。 3 .3 .1 .9 细胞记数,使细胞终浓度为1 x 1 0 6 /m L ~5 1 0 6 /m L 。 3 .3 .2 细胞反应程序 3 .3 .2 .1 采用2 .0m L 离心管,每一动物品系均设立空白对照和补体对照。 3 .3 .2 .2 每管中加入2 0p L 充分摇匀的细胞悬液,然后加入2 0p L 抗体 对照管中只加2 0 N 小牛血 清 充分摇匀,3 7 ℃水浴中保温1 5m i n 。 3 .3 .2 .3 每管加3 0p L 补体 用2 0 N d 、牛血清2 倍稀释 ,空白对照只加2 0 %小牛血清,3 7 ℃水浴中 反应3 0m i n ~4 0r a i n 。 3 .3 .2 .4 每管中加入2 0p LE o s i n 伊红 染色液 6 %E o s i n 用2 0 %小牛血清等倍稀释 3 7 ℃保温 1 0 r a i n 。 G B /T1 4 9 2 7 .2 2 0 0 8 3 .3 .2 .5 加入2 0p L1 0 %甲醛 固定液 以提高实验结果的稳定性。 3 .3 .2 .6 摇匀,从每管中取细胞悬液1 0 p L 加在细胞板上,在倒置显微镜下观察结果。 3 .4 实验结果评定 3 .4 .1 细胞形态判别 阳性细胞 死亡细胞 体积较大,伊红着色后失去折光性,阴性细胞 仍存活细胞 不着色,体积较小 而有折光性。 3 .4 .2 计算公式 细胞死亡率 死细胞数 全部细胞数 细胞毒指数一塞堂堂噬雎等烈羲鼍毫彝S 翁赢基嚣笔禹嚣藩訾掣囊罢梁孕圭空i 塑??c z , 3 .4 .3 判别标准 H 一2 单抗的细胞毒指数大于0 .7 0 ,判为同一单倍型。常用近交系小鼠的H 一2 单倍型参见附录A 。 G B /T1 4 9 2 7 .2 2 0 0 8 附录A 资料性附录 近交系小鼠} I - 2 单倍型 常用近交系小鼠H 一2 单倍型见表A .1 。 表A .1 常用近交系小鼠H - 2 单倍型 品系H 一2 DH 一2 KH 一2 单倍型 1 2 9bbb 6 1 5kkk C 3 Hkkk C 5 7 B L /6bb b C 5 7 B L /1 0bb b F Ⅶbbb T A lbbb T A 2bbb T 7 3 9bbb B A L B /c ddd D B A /2d d d S c U ddd d 6
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